Science重要发现：衰老细胞会导致动脉粥样硬化，清除衰老细胞可能有效防治心脑血管疾病

Science重要发现：衰老细胞会导致动脉粥样硬化，清除衰老细胞可能有效防治心脑血管疾病原文：
Jan M. van Deursen 等翻译：Enjoy, Rahim, Shine Boy 365（医药研发社交平台翻译志愿者联盟）2016-11-01

【编者按】衷心感谢杨大俊博士的推荐！我们非常喜欢《Science》近日发表的文章《Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis》。这篇重要文章的作者是来自美国梅奥诊所、荷兰格罗宁根大学、美国巴克老龄研究所和美国劳伦斯伯克利国家实验室的六位研究人员，其中通讯作者是梅奥诊所的Jan M. van Deursen博士。
翻译志愿者联盟的三位朋友，Enjoy、Rahim和Shine Boy 365，对原文进行了翻译。杨博士、Enjoy对译文进行了校对。我们对原文六位作者、杨博士、Enjoy、Rahim和Shine Boy 365致以诚挚的谢意和敬意！

本译文未包含原文中的图表、文献，仅供个人学习参考。如果希望获得英文原文，请在公众号【医药研发社交平台】后台输入您的邮箱，我们将统一发送。

摘 要

晚期动脉粥样硬化病变中存在老化的细胞，目前这些细胞在动脉粥样硬化中的作用尚不明确。利用转基因和药理学方法消除易发生动脉粥样硬化的缺乏低密度脂蛋白受体的小鼠中的衰老细胞，我们发现这些细胞在疾病的整个发病周期中都是有害的。我们发现，动脉粥样硬化发病时，泡沫状巨噬细胞与衰老标记物积聚在内皮下间隙，它们通过提高关键的动脉粥样硬化与炎症性细胞因子和趋化因子的表达来推动病理的发展。在晚期病变中，衰老的细胞通过提高蛋白酶的生产促进动脉粥样硬化斑块不稳定的特征，包括弹性纤维降解和纤维帽变薄。汇总起来，这些结果表明衰老细胞是动脉粥样硬化形成和成熟的关键因素，通过senolytic剂选择性清除这些细胞可成为治疗动脉粥样硬化的新的希望。
关于senolytic：2015年3月份，美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）、梅奥诊所 （Mayo Clinic）等机构组成的研究小组确定了一类新的药物，可在动物模型中显著减缓老化过程—缓解虚弱症状，改善心脏功能，延长健康寿命。科学家将这种新的药物称为“senolytics”。这一新的研究结果，《The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs》，发表于2015年3月9日出版的《Aging Cell》杂志上。

正 文

当氧化脂蛋白浸润动脉的内皮下层时，动脉粥样硬化开始产生，常常由于血液中载脂蛋白B的水平异常升高。化学趋化信号（从活化的血管内皮和平滑肌细胞释放的）吸引血液循环中的单核细胞，单核细胞演变为载脂的泡沫巨噬细胞。通过一个目前仍不完全清楚的机制，一些泡沫样巨噬细胞表达促炎性表位。这种促炎信号导致单核细胞的再次聚集，同时引起其他炎性细胞（包括T细胞、B细胞、树突神经和肥大神经），进一步聚集，从而使小斑块，即“脂质条纹”，发展演变为大的粥样硬化斑块。动脉粥样硬化斑块在临床上为静止还是持续病理变化由斑块的稳定性而非斑块大小决定，因为不稳定性斑块容易发生破裂，继而造成血管堵塞，血栓形成以及终端脏器受损。稳定性斑块有一个相对稳定且厚实的纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞（VSMCs）和细胞外基质组成，将可溶于血液中的凝血因子与斑块中形成血栓的分子分开。在不稳定性疾病中，当局部生成增加的基质金属蛋白酶降解纤维帽时斑块会破裂，并增加损伤破裂和随后血栓症的风险。
不稳定性动脉粥样硬化板块中存在带有衰老标记的细胞，导致发生细胞生长永久性停止的应激反应与多种生物活性分子的大量分泌相关，是指复制性衰老相关分泌表型。衰老标记物包括衰老相关的B-半乳糖苷酶（SA-B-Gal）活性、P16Ink4a, p53,和p21表达量升高（4, 5）。然而，衰老细胞是否会造成动脉粥样硬化的产生，以及通过何种机理，目前仍不清楚（6, 7）。人粥样硬化斑块内含有端粒体缩短细胞，缩短的端粒体使细胞更容易发生衰老(8)。在动脉粥样硬化ApoE–/–小鼠模型中血管平滑肌细胞（VSMCs）中端粒体结合蛋白（Trf2）表达缺失加速粥样硬化斑块生长，与观察到的衰老致动脉粥样硬化的作用结果一致，尽管目前仍无粥样硬化斑块内衰老细胞数量增加的体内证据。另外一方面，缺失参与衰老途径的关键因素，如p53, p21, or p19Arf （7, 9–11），却显示出加速动脉粥样硬化的发生发展，这意味着衰老在粥样硬化中的保护作用。研究表明人和小鼠的多态性支持这个观点：p16Ink4a and p14Arf（小鼠中未p19Arf）表达量降低，与发生粥样硬化风险的增加具有相关性（7, 12, 13）。因此，衰老细胞是加速还是延缓动脉粥样硬化的发生，仍不清楚。 我们采用基因学和药理学方法剔除粥样斑块衰老细胞，观察自然生成的衰老细胞在动脉粥样硬化发生发展不同阶段的作用。首先，我们观察到在动脉粥样硬化模型低密度脂蛋白受体缺陷小鼠（Ldlr–/–）中存在衰老细胞聚集。高脂饮食（HFD）喂养10周鼠龄小鼠，连续喂养88天。对SA b-Gal 进行染色，结果显示动脉粥样硬化斑块中存在衰老细胞，但是以低脂饮食喂养（LFD）的Ldlr–/–小鼠的正常连接处血管或主动脉均没有观察到衰老细胞(fig. S1A)。另外，粥样硬化斑块较多的主动脉弓处显示p16Ink4a, p19Arf和 多种关键SASP 成份的转录水平升高，SASP成份包括基质金属蛋白酶Mmp3和Mmp13以及炎性因子Il1a和 Tnfa（fig. S1B）。为了清除粥样硬化斑块中的衰老细胞，我们采用p16-3MR（3MR）小鼠，该小鼠为一种转基因小鼠，在p16Ink4a基因启动子的控制下，其表达单纯疱疹病毒胸苷激酶；同时通过给予小鼠丙氧鸟苷（GCV）可以清除其p16Ink4a+衰老细胞。与Ldlr–/– mice小鼠相比，高脂饮食喂养88天Ldlr–/– 3MR 小鼠，并同步给予GCV进行短期治疗，其形成的粥样硬化斑块中SA b-Gal 活性较低(fig. S1C)， 这提示Ldlr–/–;3MR 小鼠中衰老细胞得到有效清除。采用透射电镜（TEM）检查粥样硬化斑块，结果显示斑块中存在3种不同形态的细胞类型：位于内皮层的纤长带空泡细胞、具有VSMCs组织学特性的纺锤状泡沫细胞以及与载脂巨噬细胞相像的大泡沫细胞，大泡沫细胞可产生X-半乳糖（X-Gal）晶体（Fig. 1A） 。我们把这些细胞分别定义为内皮样细胞、泡沫型VSMC样细胞和泡沫型巨噬细胞样细胞，因为粥样硬化斑块中的细胞会改变其形状和其谱系标记，因此无法准确推断其细胞起源（15, 16。给予GCV治疗，可有效清除这三种类型的衰老细胞。

为了评估衰老细胞对粥样硬化斑块发生发展的影响，我们用HFD喂养10周鼠龄的Ldlr–/–;3MR小鼠，连续喂养88天，同时给予GCV或安慰剂（Fig. 1B），目的是去除p16Ink4a+细胞。为了排除3MR表达对结果的影响，我们对GCV潜在效能进行了控制，因此同时也考察了HFD喂养Ldlr–/–小鼠同步给予GCV处理后的情况。静脉注射Sudan染料对降主动脉进行En face染色，结果显示：与安慰剂治疗Ldlr–/–;3MR 或GCV治疗Ldlr–/–小鼠组相比，GCV治疗 Ldlr–/–;3MR 小鼠组的粥样硬化斑块负荷降低约60%，斑块数量和大小均降低（Fig. 1C）。同样，GCV治疗的Ldlr–/– 3MR小鼠的粥样硬化斑块负荷降低，而且头臂动脉新生内膜下的主动脉弹性纤维破坏减少（fig. S2, A to C），头臂动脉很容易快速进展为不稳定性粥样硬化斑块（17）。与安慰剂喂养的Ldlr–/– 3MR小鼠相比，GCV喂养的 Ldlr–/– 3MR小鼠的主动脉表达p16Ink4a mRNA和其他衰老标记物的量更低，从而说明GCV可有效清除p16Ink4a+衰老细胞（fig. S3A）。采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测方法对单体红色荧光蛋白转录进行分析，结果显示：HFD喂养小鼠的3MR表达升高，但给予GCV处理小鼠的3MR表达仍维持基线水平。接着再给予主动脉en face SA b-Gal 染色，结果显示衰老细胞被有效清除（fig. S3B）。而经过GCV处理的Ldlr–/– 小鼠，其SA b-Gal染色结果或其他的衰老标记物前后均无变化。经过GCV处理的Ldlr–/–小鼠和Ldlr–/– 3MR小鼠，在体重、脂肪量和脂肪沉积量方面2组无差异（fig. S4, A to D）。对循环的单核细胞、淋巴细胞、血小板和中性粒细胞无影响，这几种细胞均存在于动脉粥样硬化斑块中与LFD喂养小鼠相比，GCV治疗Ldlr–/–小鼠和Ldlr–/–3MR小鼠以及安慰剂治疗Ldlr–/– 3MR小鼠的血脂质水平均明显升高，而在HFD喂养小鼠的血脂质水平各组间无差异（fig. S4I）。因此，GCV治疗Ldlr–/– 3MR小鼠体内出现的动脉粥样硬化保护效应，是源于敲除了p16Ink4a+衰老细胞而非饮食、血脂或循环的免疫细胞的改变。利用2个独立的转基因系统[INK-ATTAC (fig. S5) (18, 19) and INK-Nitroreductase (NTR) (fig. S6)]，复制粥样硬化斑块负荷、数量和大小的降低过程；转基因系统通过明确的机理杀死p16Ink4a+衰老细胞，同时也可以应用抗衰老药物ABT263；该药物能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 和 Bcl-xL并且选择性的杀死衰老细胞（fig. S7）（20）。 
为观察衰老细胞如何驱动斑块发生发展，我们重点在容易发生斑块的血管部位研究粥样硬化的发生（21）。给予连续9天喂养高脂饮食，diet, Ldlr–/–小鼠主动脉弓的内面出现单一的脂肪条纹状斑块（Fig. 2A and fig. S8A）。非常令人吃惊，在这些早期的粥样硬化斑块中SA b-Gal 活性呈强阳性（Fig. 2A）。相反，连续9天喂养HFD的Ldlr–/– 3MR小鼠，同时给予GCV，其SA b-Gal 活性第，并且脂肪条纹状斑块小得多。用TEM对SA b-Gal 染色标本进行检查，结果显示：HFD喂养Ldlr−/−小鼠血管内脂肪条纹斑块中存在泡沫细胞巨噬细胞，这些细胞呈单层或多层排列（Fig. 2, B and C）。早期粥样硬化斑块有完整的弹性纤维，无纤维帽。不论粥样硬化斑块大小，X-Gal 晶体仅可在泡沫细胞巨噬细胞中检测到（Fig. 2, B and D）。每天给予高剂量GCV处理Ldlr–/– 3MR小鼠（连续9天喂养高脂饮食）的9天粥样硬化斑块内，泡沫细胞巨噬细胞很少出现多层排列，而且X-Gal晶体发生率极低。SA b-Gal 活性升高与p16Ink4a和其他多种衰老标记物水平的升高呈相关性，衰老标记物包括Mmp3, Mmp13, Il1a,和 Tnfa（fig. S8B）。用抗衰老药物ABT263对HFD喂养Ldlr–/–小鼠治疗9天，结果显示抗衰老药物可降低粥样硬化的病理启动（fig. S8C）。  为了明确衰老泡沫样巨噬细胞启动早期动脉粥样硬化斑块发生的机理，我们用Ldlr–/– 和 Ldlr–/– 3MR小鼠建立了9天的脂肪条纹状斑块，在给小鼠喂养HFD的同时给予3天高剂量的GCV。短期清除衰老细胞可显著降低脂肪条纹状斑块大小，并可显著降低SA b-Gal阳性强度。TEM影像学结果显示清除掉衰老细胞的斑块位点发生彻底重塑，内皮下膜内可见非细胞性碎片，以及极少量含有X-Gal晶体的泡沫性巨噬细胞（fig. S8, D and E）。RT-qPCR检测结果显示p16Ink4a 和 SASP成份（包括Mmp3, Mmp13, Il1a和Tnfa）明显减少，而且单核细胞聚集的2个关键细胞驱动子（化学因子Mcp1和白细胞受体Vcam1）也明显降低，细胞驱动子的表达部分受Tnfa驱动（Fig. 2F）。这些资料提示早期粥样硬化斑块内皮下层衰老的泡沫性巨噬细胞的升高，可增强Tnfa介导的Vcam1表达和增加Mcp1梯度，使循环的单核细胞聚集此处。

接着，我们对衰老细胞在稳定斑块（斑块形成初期）向不稳定性斑块演变过程中所扮演的角色进行了研究。尽管鼠动脉粥样硬化模型并不能发展出现与斑块破裂相关的临床症状，鼠体内不稳定性斑块模型用作人体不稳行性斑块的替代标记，包括纤维帽变薄、胶原减少，弹性纤维降解、斑块钙化等。为了评估清除衰老细胞对不稳定性斑块产生的影响，我们在动脉粥样硬化形成并成熟后期剔除其内的衰老细胞（我们连续88天喂养LDLr-/-，LDLr/-小鼠HFD，人为造成粥样硬化斑块），之后给予GCV药物100天。给予小鼠GCV过程中，分别喂养高脂或低脂性食物，继续观察已形成斑块是向不稳定性方向发展还是静止不变。与给予GCV治疗的LDLr-/-小鼠，及给予安慰剂的LDLr-/-，3MR小鼠相比，给予GCV治疗并继续喂养HFD的 LDLr-/-，3MR小鼠，结果显示动脉粥样硬化斑块发生发展延缓，观察到斑块的数量更少、斑块尺寸更小。与对照组小鼠相比，我们采用Sudan IV染色，结果发现GCV治疗并继续喂养HFD的 LDLr-/-，3MR小鼠粥样硬化斑块数量明显降低，然而主动脉处粥样硬化斑块没有发生变化，尽管SA β-gal染色和RT-qPCR检测证实3MR介导的衰老细胞死亡。不考虑饮食，衰老细胞的清除可降低炎性细胞因子和单核细胞聚集因子的表达。GCV的治疗可以降低基质金属蛋白酶的表达，而基质金属蛋白酶与斑块的不稳定相关，基质金属蛋白酶包括Mmp3，Mmp12及Mmp13 46 33559 46 15533 0 0 4309 0 0:00:07 0:00:03 0:00:04 4308，这说明清除衰老蛋白可使斑块纤维帽稳定。  为了观察成熟斑块的特点，我们对上述研究斑块进行了组织病理学分析。与喂养LFD饮食的小鼠相比，最初给予HFD喂养88天的LDLr-/-小鼠继续喂养100天后，其将主动脉处的粥样硬化斑块出现纤维帽变薄、胶原含量降低（masson’s三色染色法）和弹性纤维破坏增多（Voerhoff von Gieson染色）。与之相反，无论GCV治疗期间饮食结构如何，清除P16Ink4a+细胞后，斑块不稳定性的所有指标均呈现下降趋势。HFD喂养的小鼠形成动脉粥样硬化斑块后继续喂养LFD，小鼠头壁动脉斑块纤维帽厚度及胶原含量增加。我们对此继续开展延伸研究，通过改变LDLr-/-， 3MR小鼠HFD喂养88后，接着给予GCV注射治疗35天，同时饮食转化为喂养LHD。在此延伸实验中，清除衰老细胞能使斑块纤维帽厚度保持不变。而且斑块内泡沫样巨噬细胞数量变少，然而血管平滑肌样细胞（VSMC）数量升高，结果使VSMC/巨噬样细胞比值上升，这一指标代表斑块稳定性增加。衰老细胞的清除可以明显降低单核细胞对斑块周围内皮细胞的粘附，因此这与我们早期脂质条纹实验结论吻合，即单核趋化性的升高可部分解释衰老细胞致动脉粥样硬化的机理。本研究结果强烈证明p16 Ink4a+细胞的清除可使斑块稳定性增加。 
为了进一步研究衰老细胞驱动动脉粥样硬化发生发展的机理，我们检测了斑块衰老细胞表达致动脉粥样硬化因子的可能性。切取HFD喂养LDLr-/-，ATTAC小鼠斑块及周围组织，制备单层细胞悬浮液。通过ATTAC检测绿色荧光蛋白P16 Ink4a+细胞的阳性表达，进而收集GFP+衰老细胞和GFP-非衰老细胞，继而对此用RT-qPCR分析。GFP+衰老细胞高表达，反之则为GFP-细胞。结果得到衰老细胞表达多种致动脉粥样硬化因子，包括IL1α、Tnfa, Mmp3, Mmp12,Mmp13, Mcp1和 Vcam1。与非衰老细胞相比，衰老细胞中的IL1α，Mmp12,Mmp13, Mcp1的表达显著增加。

结 语

在不干扰细胞衰老程序的情况下，应用转基因和药理学方法清除p16 Ink4a+细胞。我们发现衰老细胞对整个动脉粥样硬化发生发展均起到有害作用。极早期的脂质条纹中含有丰富的衰老泡沫巨噬细胞，这些细胞构建了一种可上调炎性细胞因子和单核细胞趋化因子的环境，从而恶化动脉粥样硬化斑块。去除脂质条纹中P16 Ink4a+泡沫样巨噬细胞，可使动脉粥样硬化斑块显著改善。与此相比，不稳定性斑块有三种衰老细胞，形态各异，这些衰老细胞通过炎症因子和单核细胞趋化因子使动脉粥样硬化斑块变得不稳定，且可使细胞外基质加速分解。清除不稳定性斑块中的衰老细胞可阻止动脉粥样硬化的发生发展，阻止动脉粥样硬化斑块的病理性重塑（与斑块破裂相关），包括纤维帽变薄和弹性纤维降解。此外，动脉粥样硬化斑块中的衰老细胞增加关键SASP因子、炎性作用、单核细胞趋化作用和蛋白水解作用的表达，这些因子有IL1a, Mcp1, Mmp12和Mmp13。这些数据表明，衰老细胞通过分泌特异的细胞因子能直接影响动脉粥样硬化发生发展的关键环节。相比较而言，通过Senolysis可降低Mmp3, Tnfa和Vcam1的表达，但是在p16 Ink4a+细胞中这些细胞因子呈低表达，这意味着衰老细胞可间接影响动脉粥样硬化发生发展的环境。总而言之，研究结果表明，衰老细胞通过旁分泌在所有的阶段推动动脉粥样硬化的发生，因此采用无毒副作用的药物清除患者体内的衰老细胞可能起到治疗动脉粥样硬化疾病的良好作用。。

原文信息Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis

Bennett G. Childs,1 Darren J. Baker,2 Tobias Wijshake,2,3 Cheryl A. Conover,4 Judith Campisi,5,6 Jan M. van Deursen1,2*
（1）Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905, USA. （2）Department of Pediatric and Adolescent Medicine, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905,USA. （3）Department of Pediatrics, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 9713 AV Groningen, Netherlands. （4）Division of Endocrinology, Metabolism, and Nutrition, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905, USA. （5）Buck Institute for Research on Aging, Novato, CA 94945, USA.（6）Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA.*Corresponding author. Email: [e-mail]

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